內(nèi)容大綱
細胞培養(yǎng)與廢液抽吸
細胞培養(yǎng)繼代流程
廢液抽吸方法的比較
細胞培養(yǎng)的實驗室基礎(chǔ)設(shè)備
廢液處理與廢棄辦法

什么是廢液抽吸？

廢液抽吸 （aspiration / suction） 是現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)中常用的技術(shù)，用以移除細胞培養(yǎng)等實驗作的廢棄液體。

生物學(xué)中常見的細胞培養(yǎng)，是將真核或原核細胞培養(yǎng)于適宜的培養(yǎng)液 （culture medium） 環(huán)境中，使其在受控制的狀態(tài)下生長 （growth） 及增殖 （proliferation）的過程。 細胞培養(yǎng)的流程包含解凍細胞、培養(yǎng) （cell culture）、繼代培養(yǎng) （俗稱分盤，cell subculture） 及冷凍細胞等步驟。

而在細胞生長過程中會產(chǎn)生代謝物、細胞碎片等廢棄物影響細胞健康，甚至導(dǎo)致細胞凋亡。 因此在細胞培養(yǎng)過程中，需定期更換培養(yǎng)液，而移除舊有培養(yǎng)液、洗滌液的行為，則為廢液抽吸。

真空廢液抽吸裝置 （suction system， aspiration system） 常見如上圖，主要包含：

1. 真空瓶 （vacuum flask）
2. 緩沖瓶 （safety bottle）
3. 過濾器（filter）
4. 真空源 （vacuum source）：如真空泵。

連接并啟動真空泵后，細胞培養(yǎng)瓶/皿中的廢液會因壓力差而被抽吸、收集至真空瓶，緩沖瓶則做為防溢裝置使用，以避免廢液被抽吸至真空源內(nèi)。 過濾器可使用HEPA濾膜（High Efficiency Particulate Air filter 或 0.22 μm過濾器，以過濾掉廢液及空氣中的粒子、確保抽吸的效率。

細胞培養(yǎng)繼代流程

▲ 細胞培養(yǎng)前，請確認作環(huán)境符合無菌作條件，且應(yīng)避免和細菌實驗共享設(shè)備，以防污染。

1. 解凍細胞 （thawing cells）：將冷凍細胞以 37 oC 快速解凍、回溫，以避免細胞損傷。
2. 培養(yǎng) （cell culture）：依據(jù)細胞種類和濃度，將細胞和培養(yǎng)基均勻混合后，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3. 繼代培養(yǎng) （cell subculture）：當細胞生長至一定程度后，收集細胞，分殖于新的培養(yǎng)基中。
   進行繼代培養(yǎng)時，其依細胞種類不同，處理方式可分為以下兩大類：

   a. 附著型細胞 （adherent cell），又稱貼壁培養(yǎng)、單層培養(yǎng) （monolayer culture）
   

   1. 去除舊培養(yǎng)基廢液
   2. 以 Phosphate buffered saline （PBS） 洗滌細胞一至二次
   3. 加入 trypsin-EDTA溶液，于 37 oC 下作用 2~20 分鐘，使細胞可自培養(yǎng)瓶/皿中脫落
   4. 加入含有血清的新鮮培養(yǎng)基中，以終止胰蛋白酶作用
   5. 將脫落的細胞及其團塊打散、混合均勻后，收集所有液體
   6. 離心后移除上清液，并添加新鮮培養(yǎng)基，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶/皿中進行培養(yǎng)

   b. 懸浮型細胞 （suspension cell），又稱懸浮培養(yǎng) （suspension culture）

   1. 將細胞培養(yǎng)液以 1000 rpm 離心 5 分鐘后，吸除上清液
   2. 加入適量新鮮培養(yǎng)基，與沉淀細胞混合均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶/皿中進行培養(yǎng)。
4. 冷凍細胞 （cryopreservation）：獲得目標細胞株后，將細胞懸浮于含有 5~10 % DMSO （二甲基亞砜，dimethyl sulfoxide） 及 30~50% FBS （胎牛血清，F(xiàn)etal Bovine Serum） 的新鮮培養(yǎng)液中，以 -80 oC 或液態(tài)氮等低溫設(shè)備保存。
5. 細胞計數(shù) （cell counting）：用以計算細胞濃度，可利用傳統(tǒng)血球計數(shù)器 （Neubauer chamber） 或自動計數(shù)器 ，計算細胞濃度可用來判斷目前細胞生長的情況。

廢液抽吸方法的比較

廢液抽吸目前有多種方法可以進行。 早期實驗室多利用移液器（pipette）或電動吸管抽吸廢液，然而因為需要重復(fù)抽吸及排除液體，長時間使用下來易造成手部不適及疲勞。 除此之外，電動吸管須搭配無菌刻度吸管使用，而現(xiàn)多使用拋棄式吸管排除污染疑慮，因此一次實驗下來通常會產(chǎn)生大量廢棄物，造成環(huán)境負擔。
現(xiàn)代實驗室則普遍會自行購置真空泵搭配真空瓶自行組裝，如此會較電動吸管有效率，且設(shè)備取得較容易，然而自組式系統(tǒng)常見許多例如：管線配置不良，造成工作環(huán)境混亂、或是玻璃吸管經(jīng)常破裂等安全性上的缺點。

Lafil 廢液抽吸系統(tǒng)及 BioDolphin 廢液抽吸套件主要為生命科學(xué)細胞培養(yǎng)或?qū)嶒炦^程中溶液抽吸應(yīng)用，可直接放置于無菌無塵作臺 （laminar flow） 使用。 Lafil 廢液抽吸系統(tǒng)整合真空源、真空瓶與廢液抽吸套件，提供實驗室一體化解決方案，更比傳統(tǒng)廢液抽吸系統(tǒng)減少一半臺面占用面積，并使用圍籬式平臺固定真空瓶，避免作者不小心碰觸瓶身而傾倒。
洛科Lafil 廢液抽吸系統(tǒng)及 BioDolphin 廢液抽吸套件

細胞培養(yǎng)實驗室基礎(chǔ)設(shè)備

廢液處理與廢棄辦法

含有危險化學(xué)品（如氯）之有機廢液應(yīng)收集至設(shè)有適當標示之專用廢液桶，不含危險化學(xué)品之其它廢液可一并收集于一般混合廢液桶，廢油則需收集于廢油桶中。 細胞培養(yǎng)用的廢液應(yīng)加入適當濃度的消毒劑，如漂白水（次氯酸鈉Sodium Hypochlorite），使細胞致死，再倒入水槽或廢液桶。 培養(yǎng)皿等生物醫(yī)療相關(guān)廢棄物則應(yīng)置于生物醫(yī)療廢棄物袋中，進行高溫高壓滅菌后以一般廢棄物丟棄，或是請依照我國生物醫(yī)療廢棄物相關(guān)規(guī)定處理。

參考資料

• Cell Culture Basics: Equipment, Fundamentals and Protocols | Technology Networks
• Cell Culture Basics, EU (vanderbilt.edu)
• Cell Culture Fundamentals: Safety Aspects of Cell Culture, Sigma-Aldrich
• Cell culture protocol, Proteintech
• Cell culture | 細胞培養(yǎng)，ACE Biolabs
• Laboratory Environmental Sample Disposal Information Document, Section 6.0, 2010, US EPA
• TISSUE CULTURE WASTE DISPOSAL GUIDELINES, 2017, Laboratory Safety, THE GEORGE WASHINGTON UNIVERSITY
• Tissue Culture Waste Disposal Guide, 2022, EHS, Weill Cornell Medicine
• 行政院環(huán)境保護署，事業(yè)廢棄物貯存清除處理方法及設(shè)施標準，環(huán)署循字第 1111016706號
• 細胞繼代培養(yǎng)，生物資源保存及研究中心-BCRC小教室